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708蛋白聚集

  發布時間:2021/4/12 點擊量:1960

AN-708蛋白聚集

概述

基于治療的蛋白質溶液聚集可能產生有害的免疫原性。對于較大尺寸的團聚體,可以測量這些團聚體,但在0.152微米范圍內的較小團聚體很難量化。動態光散射(DLS)技術可以證明聚集體的存在,但不能提供任何關于聚集體的濃度的信息。單粒光寫傳感器技術(SPOS)現在可以測量聚集蛋白的大小和濃度,并成為這一應用的技術。

引言

生物治療藥物已被證明容易誘導產生抗藥物抗體(ADA)。證據表明,蛋白質聚集具有增強免疫原性的能力,因此增強了對蛋白質單體形式的免疫反應生物治療蛋白的通常通過一系列步驟準備注射用藥物,例如:

1.蛋白質合成與純化

2.在運輸過程中為了穩定而進行凍干

3.注射前的復溶

雖然凍干的好處是可以穩定蛋白質以供運輸,但目前還不清楚凍干蛋白質在復溶后是否會恢復到其單體狀態。如果少量的蛋白質在這一過程中聚集,就有可能引起患者對治療過程的免疫反應。

開發一種簡單的方法來測定復溶后大小與濃度的直方圖形式的聚集程度,將能夠在配制過程中篩選這些藥物,以確保在復溶后中導致單體釋放而不會產生的聚合。

 

粒子計數技術

很少有技術能夠測量目標尺寸范圍內的顆粒大小和濃度以量化蛋白質聚集。許多藥學科學家都熟悉的光阻法,因為它被用于美國USP788-注射液中的不溶性微粒和USP729測量脂質乳狀液尾部的試驗。但是傳統光阻法的傳感器檢測下限是1μm附近,并且濃度限制對于許多蛋白質聚集樣品來說太低。

 

PSS Accusizer FX-Nano系統(如下所示)是設計在更小的顆粒尺寸和更高的濃度下工作。這是通過使用兩個傳感器完成的;FX-Nano傳感器測量范圍為0.15-0.6μm, LE400傳感器測量范圍為0.5-400μm。新的FX-Nano傳感器使用聚焦光束來減少檢測的總體積,從而提高了傳感器的濃度限制。該傳感器與SIS進樣器聯用,使進樣體積低至250μL。此配置通過了USP787治療性蛋白注射劑中的不溶性微粒。

通過兩個傳感器一次就能測試聚合蛋白的大小和濃度,它的動態范圍是0.15 -40µm 。LE傳感器單獨使用時的工作范圍為0.5 -400 µm,這使它成為非常靈活的系統。

 

案例1:過濾前后的免疫球蛋白

免疫球蛋白(IgG),約150 kDa, 1% PBS。使用FXLE傳感器以及SIS采樣器的Accusizer FX- nano來測量未稀釋的樣品。結果如圖1所示。總顆粒計數= 109,343,濃度= 9.7 x 108/mL

1:未過濾的IgG

 

使用PSSNicomp 380動態光散射儀測試它,通過圖2,以評估單體的大小并大致了解聚集蛋白的大小。峰#1(天然蛋白):14.6nm,強度52%(總質量99.6%)。2號峰(聚集的尾巴):395nm,強度為48%(總質量的0.4%)。 AccuSizer FX-Nano被用于詳細研究聚集體在200-500 nm或更大尾端。

2: DLS Nicomp380測試未過濾IgG的數據

 

蛋白質樣品然后通過0.2µm再次過濾后,使用AccuSizer FX-Nano系統分析。過濾前后的對比結果如圖3所示。PBS的結果也顯示為黑色。過濾后的濃度從9.7×108/mL降低到3.1×108/mL。AccuSizer FX-Nano系統可以清楚地看到聚集顆粒尾巴的減少,并且可以輕松識別。

3:過濾前(藍色)和過濾后(紅色)。

 

案例2孵放前后的免疫球蛋白

樣品制備用于研究孵育對IgG蛋白樣品的影響。圖4顯示了在37°C孵育之前,然后在孵育16小時后IgG樣品的粒徑分布。僅使用AccuSizer FX系統測量樣品。將聚集蛋白定義為> 0.7μm,濃度降低如下:9.777.75,降至5.08 x 105/ mL。顯然,這種聚集程度隨熱培養的增加而降低,表明溶出度提高。聚集體的尾部在圖5中進行了放大,以獲得更多詳細信息。

4:時間0(藍色)1小時(紅色)6小時(黑色)

 

5:聚集蛋白尾部的放大

 

案例2:蛋白質在不同的儲存和加工條件

客戶提供了未知的蛋白質。在AccuSizer FX-Nano上分析了緩沖液和三種不同的制備/存儲條件,以確定顆粒大小和聚集蛋白的濃度。表1中顯示了緩沖液和蛋白質樣品中> 0.19 µm的顆粒濃度。圖6中的差異計數格式和圖7中的累積格式顯示了圖形結果。

1:緩沖液和三個蛋白樣品的顆粒濃度

 

6:差異分布

 

7:累積分布

 

8和圖9顯示了相同的聚合蛋白數據,但Y軸上的濃度以對數標度表示,以便更好地顯示結果的大濃度范圍。

8:微分分布,對數尺度

 

9:積分分布,對數尺度

 

結論

AccuSizer FX-Nano提供了一種分析工具,能夠輕松量化蛋白質聚集體的大小和濃度。*的兩個傳感器方法涵蓋了動態范圍的廣泛動態范圍,可提供聚集蛋白尾巴的詳細高分辨率視圖。的計數/ mL數據可用于比較不同濃度樣品的結果。SIS采樣器可以處理此應用程序所需的小樣本量。另外,通過移除FX-Nano傳感器,該系統可用于標準的USP <787><788>注射用顆粒物。

 

 

 

 

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